体内法:转化宿主细胞的培养
- 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)是一种常用的分子生物学技术,被广泛应用于基因技术
- 它被描述为体外DNA扩增法
- 基因克隆也可以进行在体内,使用细菌
- 细菌是这种方法最常见的宿主细胞,因为它们的数量会迅速增加,而且相对容易培养
在活的有机体内基因克隆
- 这个过程涉及几个步骤
- 一个DNA片段被分离出来
- 想要的基因可以通过三种方法中的一种获得
- 使用限制性内切酶提取
- 利用逆转录酶将mRNA转化为cDNA
- “基因机器”中的人工合成
- 启动子和终止子区域被添加到DNA片段中以确保复制
- 想要的基因可以通过三种方法中的一种获得
- DNA片段被插入载体中
- 限制性内切酶和连接酶用于将DNA片段插入载体
- 质粒是常用的载体
- 载体被运送到细菌宿主细胞中
- 含有修饰质粒的细胞描述为转化的宿主细胞
- 细菌在数量上繁殖
- 在最佳条件下,细菌数量迅速增加
- 标记基因被用来识别成功转化的细菌
- 只有一小部分细菌会占据含有所需基因的质粒
- 那些已经占据质粒的可以通过标记进行识别
- 标记-编码可被追踪的可识别物质的基因(例如;GFP——在紫外光下荧光的绿色荧光蛋白或GUS——一种β-葡萄糖醛酸酶,将无色或非荧光底物转化为彩色或荧光产品)
- 那些没有携带所需基因的基因会被破坏
- 剩下的细菌被培养
- 细菌每分裂一次,所需要的基因就被克隆出来
以细菌为宿主细胞进行体内基因克隆的步骤
- 重组DNA可以用来生产重组蛋白(RP)
- 细菌经基因工程改造后可产生人体蛋白质胰岛素治疗糖尿病
对生物体进行基因工程所采取的步骤的概述(在这种情况下,细菌被基因工程用于生产人类胰岛素)
考试技巧
考试中不需要回忆特定的标记基因。